Страница: 1/38
Необратимое осаждение белков.
Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием конц. р-ров минеральных и органических к-т, солями тяжелых металлов.
Осаждение при кипячении.
Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60°С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствми – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных р-рах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в р-ре.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) уксусная к-та, 1% и 10% р-ры; 3) NaOH, 10% р-р.
Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель р-ра яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом р-р мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства ( его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его р-р приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд ( один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд ( сохраняется один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю р-ра NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.
Осаждение концентрированными минеральными к-тами.
Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в р-ре (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной к-т выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной к-ты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная к-та.
Реактивы: 1) яичный белок,1% р-р; 2) конц. серная к-та; 3) конц. хлористоводородная к-та; 4) конц. азотная к-та.
Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной к-т. затем, наклонив пробирку под углом 45°, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной к-тами, в пробирке с азотной к-ой растворения белка не происходит.
Осаждение органическими к-ами.
Трихлоруксусноая к-та осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой к-ой пользуются при определении белка в моче.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) трихлоруксусная к-та, 10% р-р; 3) сульфосалициловая к-та, 10% р-р.
Реферат опубликован: 3/06/2006